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仙人掌中生物堿類提取物抗腫瘤作用的研究
發布時間:2018-11-22   點擊次數:760次

仙人掌肉質莖中含有多種生物堿, 其中主要為酪胺、N- 甲基酪胺、3- 甲氧基酪胺、β- 苯乙胺、大麥芽堿等酪胺更是仙人掌中生物堿的重要成分。接下來給大家介紹用CO2培養箱從仙人掌里面提取生物堿時所需設備及實驗方法如下:

實驗對象:HL-60細胞

   提取實驗所需儀器:熒光倒置顯微鏡、凈化工作臺、1640培養基、高速冷凍式離心機、實驗室超純水器、立式壓力蒸汽滅菌器、酶標儀、離心沉淀器、遠紅外干燥箱、恒溫加熱磁力攪拌器、轉蒸發儀、電熱恒溫水浴鍋、循環水式真空泵、紫外分光光度計、電熱套、圓底燒瓶、蛇形冷凝管、布氏漏斗、分液漏斗、分析天平、容量瓶、量筒、燒杯、膠頭滴管、移液管、比色管。

   實驗試劑:Sigmo MTT試劑、臺盼藍染液、1640培養液、乙醇、甲醇、1 mol / L的硫酸,、濃氨水、改良碘化鉍鉀試劑、酪胺標準溶液、KB r粉末。

方法

    1、仙人掌中生物堿的提取分離與精制將仙人掌粉碎,取細粉20g,在條件為:乙醇濃度95 % 、物料比1∶15 、提取溫度50 ℃、提取時間3 h的條件下,乘熱抽濾,濾渣再于同一條件下提取2h,乘熱抽濾,合并濾液,濾液減壓于水浴鍋中濃縮,再將濾液放冷析出結晶,得粗提物。向粗提物中加入適量1 mol / L 的硫酸, 形成酸水液和沉淀, 濾去酸水液中的沉淀, 加入適量的濃氨水調至pH 值9 ~10 。然后用分液漏斗萃取3-4h后,用旋轉蒸發儀進行濃縮后抽濾,得總生物堿。

   2、仙人掌中生物堿類物質的鑒定

   化學法檢查:將提取的總生物堿液,用1%的鹽酸萃取,得鹽酸溶液10毫升,分為四個小試管儲存,分別在四個小試管中加入改良碘化鉍鉀、碘-碘化鉀、硅鎢酸試劑,觀察各試管中的變化。

   薄層層析檢查:取總生物堿少許—丙酮—甲醇(6∶1∶1)溶解, 用毛細管點樣于預先制備好的硅膠GF254 板上, 上行法展開。當展開劑跑至硅膠板前沿約1~2cm 處時, 取出, 揮干溶劑。先觀察熒光, 后用改良碘化鉍鉀試劑噴霧顯色,觀察斑點位置及顏色,同時用酪胺標準品作對照。

   3、白血病
   HL-60細胞培養人早幼粒白血病細胞HL-60培養于含10%小牛血清的RPMI 1640培養液中,加青霉素100μg·mL-1,鏈霉素100μg·mL-1,置于5% CO2培養箱中,37℃飽和培養。
   4 、總生物堿的抑瘤實驗準備工作把總生物堿提取物用牛皮紙封好口,離心管與培養瓶放在鋁制盒里,和替補頭一起在壓力蒸汽滅菌器里滅菌,20分鐘后放入遠紅外干燥箱干燥后備用。

   5、接種細胞

   取對數期生長的HL-60細胞,用離心機1000rmp離心10min后,小心棄去上清液,分別與0.25%胰蛋白酶消化液、0.02%EDTA混合消化后調節細胞濃度為1×105 個/ml的單細胞混懸液,每孔150ul接種于96孔培養板中,置5% CO2培養箱中,37℃的培養過夜,備用。

   6、加藥培養
   將提取物制備成10個不同濃度劑量,分別為:5,10,20,50,100,200,400,600,800,1000ug/ml。

   7、再將不同濃度的提取物

50ul分別加入各接種了HL-60細胞的試驗孔中,平行5孔

   8、設置只加細胞,

不加藥液的對照孔和只加培養液的空白孔,均平行5孔,繼續培養24、48、72h

   9、熒光倒置顯微鏡觀察法測定
在加藥培養前和加藥培養后的24、48、72h于熒光倒置顯微鏡下觀察實驗組與空白組不同時期細胞的生長狀態及細胞形態。
   10、MTT法檢測
取處于指數生長期的HL-60細胞,用離心機1000rmp離心10min后,小心棄去上清液,分別與0.25%胰蛋白酶消化液、0.02%EDTA混合消化后調節細胞濃度為1×104個/ml的單細胞混懸液,每孔150ul接種于96孔培養板中,并設空白對照孔,只加培養液,不加細胞,置5% CO2,37℃的CO2培養箱中過夜。
   11、換液,加入受試藥物,50μl/ 孔,每個濃度設5 個重復,細胞在相同條件下繼續培養4 8 h 后,加入MTT20μl/ 孔(5mg/ml),置于37℃CO2培養箱中、置5% CO2 反應4h。
   12、小心吸去上清液,加入DMSO 溶解,每孔150μl,平板搖床上振搖5min。用酶標儀在波長為570nm 處測定每孔的OD值,測時須減去空白對照,實驗重復三次。
   13、計算細胞存活率及藥物對細胞的抑制率。
細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100% 細胞抑制率(%)= (1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%

以上內容僅供參考,如需了解詳情請聯系喆圖客服!

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