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細胞培養FAQ匯總
發布時間:2019-04-01   點擊次數:612次

 

        在細胞培養的過程中,經常會出現各種各樣的問題。為了大家能夠更好的進行細胞培養,本文對實驗中常出現的問題進行了匯總,方便大家查詢和學習。

        問題1:血清中可能出現的沉淀物是什么?

        基于多年的實驗研究,用于細胞培養的胎牛血清以及其它血清中可能會存在以下種類的沉淀物:

1、纖維蛋白,它是經常出現的較大的沉淀物,可以達到1-2mm,可以用肉眼觀察到。因為血清都是在低溫下進行收集和快速處理的,一些纖維蛋白原(可溶性的形成絮狀纖維蛋白的前體)在處理過程中仍然處于溶解狀態,當經過MAX后的過濾分裝后,就會在瓶中凝結出現纖維蛋白沉淀。

2、磷酸鈣,它也是常見的一種沉淀物,通常會使血清出現渾濁,并且在37℃培養的時候會增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點,這些小黑點由于布朗運動看上去可以活動,因此經常被誤認為是微生物污染。

3、膽固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白質。他們也是血清中出現沉淀物的常見原因。

 

        問題2:血清中的沉淀物對細胞培養有什么影響?

1、細胞生長,我們的試驗以及經驗表明沉淀物不會影響細胞培養,我們的客戶以及其它血清生產商也證明了這一點。

2、過濾,如果血清中出現大量的沉淀物,血清將很難過濾。一般說來,因為在血清生產時MAX后已經經過100nm或者40nm的過濾處理,并且經過了嚴格的無菌檢測,因此不推薦再過濾用于細胞培養的血清。在實驗室中沒有必要再過濾處理血清,以免操作不規范導致污染的發生。

3、污染,磷酸鈣往往被誤認為微生物污染而引起爭端。研究者可能會在血清中觀察到一些絮狀的沉淀,因此就會比較警覺的去做無菌試驗,將血清放在培養箱中培養幾天,結果可能會觀察到更多的絮狀沉淀,因此就斷定血清被污染了。并且當研究者將血清樣品放在倒置顯微鏡下觀察時往往可以看到一些可以運動的小黑點,因此就更加確認是血清被污染了。于是,研究者就會花費更多的時間和精力來和生產商確認,但MAX終確定血清沒有被污染而只是沉淀。為了避免這些問題的發生,我們建議不要直接將血清放在培養箱中培養觀察是否有菌,而是將血清加到瓊脂板上進行培養以觀察是否有細菌生長。另外,也可以進行革蘭氏染色,在油鏡下觀察,以確認是否有污染。

 

        問題3:如何避免血清中沉淀物的出現?

        首先要注意正確的血清解凍步驟,而且溶解過程中一定要每隔一段時間均勻而緩慢的搖動血清。我們已經發現在下列情況下沉淀物可能增加,使用中應該盡量避免:

1、熱滅活血清;

2、使用電熱恒溫培養箱在37℃下培養血清;

3、反復凍融;

4、γ射線照射;

5、長期儲存在2-8℃;

6、在室溫下放置時間過長

 

        問題4:如何去除血清中的沉淀?

        如果想去除這些絮狀沉淀物,可以將血清分裝到無菌離心管中,以400g離心1~2min,上清液即可直接加入到培養基內使用。

注意:不要以過濾的方式去除這些絮狀沉淀物,因為這可能阻塞濾膜。

 

        問題5:凍存管應如何解凍?

        取出凍存管后,須立即放入37°C水槽中快速解凍,輕搖凍存管使其在1分鐘內全部融化,并注意水面不可超過凍存管蓋沿,否則易發生污染情形。另凍存管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,預防凍存管發生爆裂。

 

        問題6:細胞凍存管解凍培養時,是否應馬上去除DMSO?

除少數特別注明對DMSO敏感的細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮細胞),在解凍后,都應直接放入含有10-15ml新鮮培養基的培養瓶中,待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO即可,如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。

 

        問題7:一般在拿到細胞后,應該注意什么?

        收到細胞后先不要開蓋,放在二氧化碳培養箱內靜置若干小時后(看細胞密度而定)在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,并對細胞進行不同倍數拍照(建議對收細胞時的培養基拍一張照片,觀察培養基的顏色和是否有漏液情況,顯微鏡下拍細胞100X,200X各一張),排除細胞本身污染的情況;收到細胞未開封,出現污染狀況一般可以再申請免費發送一株細胞。

        收到細胞時如無異常情況,請在顯微鏡下觀察細胞密度,如為貼壁細胞,未超過80%匯合度時,將培養瓶中培養液吸出,留下10ml培養液繼續培養;超過80%匯合度時,請按細胞培養條件傳代培養。如為懸浮細胞,吸出培養液、1000轉/分鐘離心2分鐘,吸出上清,管底細胞用新鮮培養基懸浮細胞后移回培養瓶。

        細胞消化液建議使用PBS配制,慎用Hanks液配制。

 

        問題8:可否使用與原先培養條件不同的培養基?

        一般不建議。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養基,若驟然使用和原先提供的培養條件不同的培養基,細胞大都無法立即適應,造成細胞無法存活。

 

        問題9:可否使用與原先培養條件不同的血清種類?

        不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

 

        問題10:L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?

        L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有MAX終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。

 

        問題11:培養細胞時應使用5%或10%CO2?或根本沒有影響?

        一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統,而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中NaHCO3含量為每公升3.7g時,細胞培養時應使用10%CO2;當培養基中NaHCO3為每公升1.5g時,則應使用5CO2培養細胞。

 

        問題12:何時須更換培養基?

        視細胞生長密度而定,或遵照細胞株基本數據上的更換時間,按時更換培養基即可。

 

        問題13:培養基中是否須添加抗生素?

        除于特殊篩選系統中外,一般正常培養狀態下,培養基中不應添加任何抗生素。

        如果是沒有進行過細胞培養的新手,對無菌技術沒有信心的,或者提取的原代細胞,怕污染的,可以適量添加抗生素。

        抗生素本身也是有毒性的,有些抗生素的藥效濃度水平與毒效濃度水平非常接近,對細胞多少有傷害。

 

        問題14:懸浮性細胞應如何傳代處理?

        一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中,稀釋細胞濃度即可,若培養液太多時,可將培養角瓶口端稍微抬高,直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶,加入新鮮培養基稀釋至適當濃度,重復前述步驟即可。

 

        問題15:想將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?

        回收動物細胞,其離心速率一般為300xg(約1000rpm),5-10分鐘,過高之轉速,將造成細胞死亡。

 

        問題16:細胞的接種密度為何?

        依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

 

        問題17:細胞冷凍培養基之成份為何?

        動物細胞冷凍保存時MAX常使用的冷凍培養基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO稀釋時會放出大量熱能,故不可將DMSO直接加入細胞液中,必須使用前先行配制完成。

 

        問題18:冷凍保存細胞的方法?

        冷凍保存方法一:冷凍管置于4°C30-0分鐘→(-20°C30分鐘*)→-80°C16~18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。冷凍保存方法二:冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3°C至–80°C以下,再放入液氮槽vaporphase長期儲存。-20°C不可超過1小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

 

        問題19:細胞要冷凍保存時,細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?

        冷凍管內細胞數目一般為1x106cells/mlvial,融合瘤細胞則以5x106cells/mlvial為宜。

        問題20:應如何避免細胞污染?

        細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒、原蟲、支原體。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染的血清和污染的細胞等。嚴格的無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好的細胞來源和培養基配制是減低污染MAX適合的方法。

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