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微生物菌種保藏小方法
發布時間:2019-04-02   點擊次數:475次

 

       微生物在使用和傳代過程中容易發生污染、變異甚至死亡,因而常常造成菌種的衰退,并有可能使優良菌種丟失。菌種保藏的重要意義就在于盡可能保持其原有性狀和活力的穩定,確保菌種不死亡、不變異、不被污染,以達到便于研究、交換和使用等諸方面的需要。菌種存放的方法有哪些呢?

      傳代保存

  有些微生物當遇到冷凍或干燥等處理時,會很快死亡,因此在這種情況下,只能求助于傳代培養保存法。傳代培養就是要定期地進行菌種轉接、培養后再保存,它是MAX基本的微生物保存法,例如酸奶等常用生產菌種的保存。

  傳代保存時,培養基的濃度不宜過高,營養成分不宜過于豐富,尤其是碳水化合物的濃度應在可能的范圍內盡量降低。培養溫度通常以稍低于MAX適生長溫度為好。若為產酸菌種,則應在培養基中添加少量碳酸鈣。

  一般地,大多數菌種的保藏溫度以5℃為好,像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用恒溫培養箱37℃進行保存,而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。

  傳代培養保存法雖然簡便,但其缺點也很明顯,如:①菌種管棉塞經常容易發霉;②菌株的遺傳性狀容易發生變異;③反復傳代時,菌株的病原性、形成生理活性物質的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期轉種,工作量大;⑤雜菌的污染機會較多。

      液體石蠟覆蓋保存法

  該法較前一種方法保存菌種的時間更長,適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細菌等的保存。此法可防止干燥,并通過限制氧的供給而達到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡便的優點,同時也適用于不宜冷凍干燥的微生物(如產孢能力低的絲狀菌)的保存,而某些細菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進行保存。

      懸液保存法

  即使微生物混懸于適當溶液中進行保存的方法。常用的有:

 ?、?蒸餾水保存法:適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌,將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數年。本法應注意避免水分的蒸發。

 ?、?糖液保存法:適用于酵母菌,如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗處保存,可長達10年。除此之外,也可使用緩沖液或食鹽水等進行保存。

      載體保存法

  將微生物吸附在適當載體上進行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種:

      ①土壤保存法

  主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液,立即在室溫下進行干燥或使菌體繁殖后再干燥,然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜,土壤需風干、粉碎、過篩和滅菌。

  使微生物在土壤中繁殖后進行干燥保存的方法是:取適量土壤(5克)置于塞有棉塞的試管中,加水或加入充分稀釋的液體培養基(以含水量為土壤MAX大持水量的60%為宜),然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種,培養至菌絲能用肉眼確認的程度為止,移入干燥器中經短時間干燥或風干后密封,冷藏或室溫保存。

      ②砂土保存法

  取清潔的砂,過60目篩去掉大砂粒,并用磁鐵吸去砂中鐵屑,再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗數次,干燥后,置于試管或安瓶管中保持2~3cm深,再經干熱滅菌后,加入1ml菌種培養液,經充分混勻后,放入真空干燥器中,完全干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂(經HCl預處理)和一份貧瘠、過篩的黃土攙和后滅菌,再進行菌種保存。

      ③硅膠保存法

  以6~16目的無色硅膠代替砂子,干熱滅菌后,加入菌液。加菌液時,由于硅膠的吸附熱常使溫度升高,因而需設法加以冷卻。

      ④磁珠保存法

  將菌液浸入素燒磁珠(或多孔玻璃珠)后再進行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無水CaSO4),上鋪玻璃棉,再放上10~20粒磁珠,經干熱滅菌后,接入菌懸液,MAX后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對酵母菌很有效,特別適用于根瘤菌,可保存長達兩年半時間。

      ⑤麩皮保存法

  在麩皮內加入60%的水,經滅菌后接種培養,MAX后干燥保藏。

      ⑥紙片(濾紙)保存法

  將滅菌紙片浸入培養液或菌懸液中,常壓或減壓干燥后,置于裝有干燥劑的容器內進行保存。

       寄主保存法

  微生物侵入其寄主后加以保存的方法。

       冷凍保存法

  適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷,而對其它大多數微生物而言,無論在細胞外凍結還是在細胞內凍結,都會對菌體造成損傷,因此當采用這種保藏方法時,應注意以下幾點:

 ?、?要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞;

 ?、?要選擇適宜的培養基,因為某些微生物對冷凍的抵抗力,常隨培養基成分的變化而顯示出巨大差異;

 ?、?要選擇合適的菌液濃度,通常菌液濃度越高,生存率越高,保存期也越長;

 ?、?建議在菌液內不添加電解質(如食鹽等);

 ?、?可在菌液內添加甘油等保護劑,以防止在冷凍過程中出現菌體大量死亡的現象。同樣,也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑,但對有些微生物而言,不加保護劑時更有效。

 ?、?原則上應盡快進行冷凍處理,但當加入保護劑時,可靜置一段時間后再進行處理。

 ?、?就動物細胞而言,應在-20℃范圍內以1℃/min左右的速度緩慢降溫,此后必須盡快降到貯藏溫度;而對絕大多數微生物而言,則不必如此,如結構較為復雜的原蟲則可在-35℃范圍內進行緩慢降溫,而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍;

 ?、?若進行長期保存,則貯藏溫度越低越好;

 ?、?取用冷凍保存的菌種時,應采取速融措施,即在35~40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說,則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后,應盡量避免再次冷凍,否則菌體的存活率將顯著下降。

      常用的冷凍保存法

 ?、?低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃):低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便,也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多,有些可添加保護劑。此外,也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器內,再放入低溫冰箱內進行保存的。

 ?、?干冰保存法(-70℃左右):即將菌種管插入干冰內,再置于冰箱內進行冷凍保存。

 ?、?液氮保存法(-196℃):是適用范圍MAX廣的微生物保存法。其操作步驟如下:

  a.裝安瓶管:使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中,將0.2~1ml的這種溶液分裝于安瓶中,或在裝有分散劑的安瓶中直接接種,或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。

  b.熔封安瓶管:若直接貯存于氣相液氮中(-150℃~-170℃)時,則不需熔封。

  c.檢查安瓶管是否熔封良好:即在4℃下,將熔封安瓶管在適當的色素溶液中浸泡2~30分鐘后,觀察有無色素進入安瓶。

  d.緩慢冷卻:將熔封安瓶管置于小罐中,然后用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至-25℃左右,也可在-20℃~-25℃的冰箱內緩慢冷卻30~60min。

  e.速冷:MAX后浸入液氮中快速冷卻至-196℃。

      冷凍干燥保存法

  它的原理是首先將微生物冷凍,然后在減壓下利用升華現象除去水分。從菌體中除去大部分水分后,細胞的生理活動就會停止,因此可以達到長期維持生命狀態的目的。該方法適用于絕大多數微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。在進行冷凍干燥時,需注意以下幾個問題:

  a.冷凍干燥前的培養條件:首先檢驗菌種純度。一般地說,將待保存的微生物在營養豐富且容易增菌的培養基上進行培養為宜;菌齡以達到對數生長期為好;若為有芽孢或孢子的微生物,則以芽孢和孢子形成以后進行保存為好;菌液濃度以高為好,如細菌應達到109~1010/ml。

  b.菌株號碼等的標記:可在安瓶外側標記或在安瓶內封入標簽。

  c.安瓶的準備:將安瓶在2%HCl中浸泡過夜,自來水沖洗3次后,蒸餾水刷凈,干燥,塞棉塞,貼標簽,干熱滅菌或溫熱滅菌后,恒溫培養箱60℃恒溫干燥。

  d.添加保護劑:常用的保護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。

       Bordelli氏法

  取干凈的小試管(8×60mm)塞上棉塞,滅菌。用滅菌的脫脂牛乳洗脫試管斜面上的菌苔,制成濃厚菌懸液。然后用無菌吸管將菌懸液滴入小試管底部。每管一滴,然后轉動小試管使菌液分散在試管底部的壁上。標記菌名。將小試管裝在15×150mm的試管中,在大試管底部事先裝上1.5cm高的(P2O5或KOH),管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊,蠟封。將大試管與真空泵連通,抽真空至0.1~0.2mm汞柱時,將玻璃管熔封,置室溫暗處或冰箱保存。

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