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牛奶中β-內酰胺酶檢測方法
發布時間:2019-05-08   點擊次數:888次

        “無抗奶”,顧名思義,即不含抗生素的牛奶。早在2002年,這一概念便被提出,“無抗生素”的字樣也登上了乳品包裝。

        為何牛奶含抗生素?

        牛奶中的抗生素來自乳牛,乳牛被注射抗生素,主要是治療乳腺發炎。乳腺炎是奶牛常見病,抗生素的使用是業內“公開的秘密”。牛奶中的抗生素可能導致飲用者過敏,或因長期接觸抗生素而耐藥。

        如何做到“無抗”?

        藥品合理間隔期后才擠奶,可以生產無抗奶,可以通過檢驗抗生素的方式驗證。

        1、間接法

        方法原理:利用β-內酰胺酶能夠酶解青霉素的原理,向牛奶中添加一定量的青霉素,如果牛奶中存在一定濃度的β-內酰胺酶,那么青霉素經β-內酰胺酶酶解后濃度會減少,從而判斷牛奶中是否存在β-內酰胺酶。

        實驗步驟:稱取20 g試樣,在4℃、16000rpm條件下離心10 min。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管,并將塑料離心管置于37℃水浴鍋中振蕩孵育30 min。向孵育后的離心管中加入無水乙醇15 mL。振蕩提取30 min后離心,將上層清液過濾紙后收集于梨形瓶中。減壓濃縮蒸發掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸鹽緩沖液(pH=8.5),渦旋1 min后調節pH為8.5。以1 mL/min的速度將提取液通過經過預處理的Oasis HLB固相萃取柱,用2 mL磷酸緩沖液(pH=8.5)淋洗萃取柱,再用2 mL水淋洗。MAX后用3 mL乙腈洗脫。將洗脫液在40℃下氮氣吹干,用0.025 M磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)定容殘渣至1 mL,待上機測定。

        色譜條件:LabAlliance PC-2000液相色譜配500型紫外檢測器;

          lanbo色譜柱 :C18(4.6mm×150mm×5μm);

          流動相: 甲醇/0.004M 磷酸二氫鉀(pH=4.5)=40/60;

          檢測波長: 268 nm

        2、直接法

        方法原理:牛乳中的青霉素鉀在β-內酰胺酶的作用下,主要生成青霉噻唑酸鉀,并伴隨生成少量的青霉胺、青霉醛等物質。經去脂肪、蛋白等前處理后,可以將青霉噻唑酸鉀提取出來,經液相色譜儀檢測確認其是否存在,從而判定該牛乳是否為人造“無抗奶”。

        實驗步驟:稱取20 g試樣,在4 ℃、16000 rpm條件下離心10 min。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管,加入無水乙醇15 mL,振蕩提取30 min后離心,取清液經0.45 μm的濾膜過濾,用液相色譜儀檢測。

        標準溶液配制:稱取0.01 g(至0.001 g)青霉素鉀于100 ml容量瓶中,加入1ml市售抗生素分解劑,室溫放置2h使青霉素鉀酶解完全后用去離子水定容,得到青霉噻唑酸鉀標準溶液,濃度100 μg/mL。根據實際情況稀釋后使用。

        色譜條件:LabAlliance PC-2000液相色譜配2000型紫外檢測器;

         lanbo色譜柱 :C18(4.6mm×150mm×5μm);

          流動相: 甲醇/0.004 M磷酸二氫鉀(pH=4.5)=40/60;

          檢測波長: 230 nm

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