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大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化
發布時間:2019-05-09   點擊次數:2044次

         [實驗目的]

通過本實驗,掌握大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化的方法和技術

        [實驗原理]

        細菌處于容易吸收外源DNA 的狀態叫感受態。轉化是指質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。其原理是細菌處于0℃,CaCl2低滲溶液中,菌細胞膨脹成球形。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面,經42℃短時間熱擊處理,促進細胞吸收DNA復合物。將細菌放置在非選擇性培養基中保溫一段時間,促使在轉化過程中獲得的新的表型(如Ampr等)得到表達,然后將此細菌培養物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養基上。

        [實驗儀器與設備]

1.超凈工作臺 2.低溫離心機

3. 恒溫搖床 4.電熱恒溫培養箱

5. -70℃ 6. 恒溫水浴器

        [實驗材料]

1.氯化鈣(CaCl2) 2.胰蛋白胨

3.酵母提取物 4.氯化鈉(NaCl)

5.氨芐青霉素 6.大腸桿菌DH5α

7.pUC19質粒 8. 50ml離心管

9.吸頭、培養皿、錐形瓶等

        附試劑的配制:

1. 0.1mol/L CaCl2溶液

2. LB液體培養基

配制每升培養基,應在950ml去離子水中加入:

胰蛋白胨(bacto-typtone) 10g

酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g

NaCl 10g

搖動容器直至溶質完全溶解,用NaOH調節pH至7.0,加入去離子水至總體積為1L,121℃濕熱滅菌20min。

3.氨芐青霉素(Amp),用無菌水配制成100mg/ml溶液,置-20℃冰箱保存。

        [實驗步驟]

1.從大腸桿菌DH5α平板上挑取一個單菌落接于2ml LB液體培養基的試管中,37℃振蕩培養過夜。

2.取0.5 ml菌液轉接到一個含有50ml LB液體培養基錐形瓶中, 37℃振蕩培養2-3h.(此時,OD600<=0.5,細胞數務必<108/ ml,此為實驗成功的關鍵).

3.將菌液轉移到50 ml離心管中,冰上放置10min.

4.離心10min(4000rpm),回收細胞.

5.倒出培養液,將管倒置1min以便培養液流盡.

6.用冰冷的0.1mol/L CaCl210ml懸浮沉淀,立即放在冰上保溫30min。

7.0-4℃6000rpm,離心10min,回收細胞。

8.用冰冷的0.1mol/L CaCl22ml懸浮細胞 。(務心放冰上)

9.分裝細胞,每200μl一份。此細胞為感受態細胞。

10.取200μl新鮮配制的感受態細胞,加入DNA 2μl(50ng)混勻,冰上放置30min。

        同時做兩個對照管:

受體菌對照:200μl感受態細胞+2μl無菌水

質粒對照:200μl 0.1mol/L CaCl2溶液+2μl質粒DNA溶液

11.將管放到42℃循環水浴1-2min。

12.冰浴2min.

13.每管加800μl LB液體培養基,37℃培養1h(慢搖)。

14.將適當體積已轉化的感受態細胞,涂在含有氨芐青霉素的固體培養基上。

15.倒置平皿在電熱恒溫培養箱內37℃培養12-16h,出現菌落。

[實驗安排]

15學時

第1天下午—第2天上午:配LB培養基,接種,液體培養

第2天上午、下午:繼續培養2-3h,制備感受態細胞,轉化,培養12-16h

第3天上午:觀察結果

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