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蛋白質濃度測定
發布時間:2019-05-16   點擊次數:260次

         測定蛋白質濃度的方法有很多,科研工作者廣泛使用的方法比如紫外吸收法,雙縮脲法,BCA方法,Lowry法,考馬斯亮藍法,凱氏定氮法等等 ,今天小編以UV法,BCA法,考馬斯亮藍法,其中的三種方法的測定蛋白質濃度的原理、優缺點、操作以及注意事項做詳細介紹。
         UV法
         這種方法是在280nm波長,直接測試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應的換算方法,將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單,先測試空白液,然后直接測試蛋白 質。從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受 到平行物質的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。
         (1)簡易經驗公式
蛋白質濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor
         (2)計算
通過計算OD280/OD260的比值,然后查表得到校正因子F,再通過如下公式計算MAX終結果:
蛋白質濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D
其中d為測定OD值比色杯的厚度
D為溶液的稀釋倍數 
         BCA法
         原理
         BCA(bicinchonininc acid)與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑混合一起即成為蘋果綠,即 BCA 工作試劑。在堿性條件下,BCA 與蛋白質結合時,蛋白質將 Cu2+ 還原為 Cu+,工作試劑由原來的蘋果綠色變為紫色復合物。562 nm 下其光吸收強度與蛋白質濃度成正比。BioVision的BCA蛋白檢測試劑盒提供了一種簡單快速并且耐去污劑(大于5%)的手段檢測溶液中蛋白質濃度.
         成分
試劑 A 100 mL
試劑 B 2 mL
標準蛋白(BSA) 1 mL×2,1 mg/mL 
保存條件
運輸溫度:室溫(標準蛋白 4~8 ℃ 運輸)
保存溫度:室溫(標準蛋白 -20 ℃ 保存)
有效日期:12 個月
         使用方法
         方法一:96 孔板
1. 配制 BCA 工作液:根據標準品和樣品數量,按 50 體積試劑 A,1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液。充分混勻。
2. 將蛋白標準品按 0 μL,1 μL,2 μL,4 μL,6 μL,8 μL,10 μL 加入 96 孔板的蛋白標準品孔中。加滅菌雙蒸水補足到 10 μL。取 10 μL 待測樣品加入 96 孔板的待測樣品孔中。每個測定要做 2~3 個平行。
3. 向待測樣品孔和蛋白標準品孔中各加入 200 μL BCA 工作液(即樣品與工作液的體積比為 1:20),混勻。
4. 37 ℃ 恒溫水浴鍋溫浴 30 min。冷卻至室溫。
5. 酶標儀 562 nm 波長下測定吸光度。
6. 制作標準曲線。從標準曲線中求出樣品濃度。
         方法二:試管法
1. 配制工作液:根據標準品和樣品數量,按 50 體積試劑 A,1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液,充分混勻。工作液配制的量要與測定所用的比色杯對應。每個測定要做 2~3 個平行。本處列舉的比色體系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯規格不同,體系需要放大到實驗將采用的比色杯準確讀數所需要的體積。
2. BSA 標準品和樣品的準備:樣品用水或其它不干擾顯色反應的緩沖液配制,使待測定的濃度位于標準曲線的線性部分。每個反應準備 3 個平行測定。標準曲線一般 5~6 個點即可。根據樣品的估測濃度確定各點的具體濃度。稀釋 BSA 時可以用水或與樣品一致的溶液。如待測樣品的濃度約為 200 μg/mL,可按下表的次序加入 BSA 標準品、樣品及 BCA 工作液。
3. 取適量體積的標準蛋白,以蛋白液:工作液=1:20 的比例混勻。37 ℃恒溫水浴鍋溫浴 30 min。冷卻至室溫。
4. 將樣品與標準品在 562 nm 波長下測定吸光度。
         考馬斯亮藍法
         實驗原理
         考馬斯亮藍 (Coomassie Brilliant Blue) 法測定蛋白質濃度,是利用蛋白質―染料結合的原理,定量測定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點,因而正在得到廣泛的應用。目前,這一方法是也靈敏度MAX高的蛋白質測定法之一。
考馬斯亮藍 G-250 染料,在酸性溶液中與蛋白質結合,使染料的MAX大吸收峰 (lmax) 的位置,由 465 nm 變為 595 nm,溶液的顏色也由棕黑色變為藍色。通過測定 595 nm 處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。研究發現,染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸 (特別是精氨酸) 和芳香族氨基酸殘基相結合。
突出優點
(1)靈敏度高,據估計比 Lowry 法約高四倍,其MAX低蛋白質檢測量可達 1 mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大,蛋白質-染料復合物有更高的消光系數,因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比 Lowry 法要大的多。
(2)測定快速、簡便,只需加一種試劑。完成一個樣品的測定,只需要 5 分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程,大約只要 2 分鐘即可完成,其顏色可以在 1 小時內保持穩定,且在 5 分鐘至 20 分鐘之間,顏色的穩定性適宜。因而完全不用像 Lowry 法那樣費時和需要嚴格地控制時間。
(3)干擾物質少。如干擾 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 離子、Tris 緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA 等均不干擾此測定法。
缺點
(1)由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考馬斯亮藍染色法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差,在制作標準曲線時通常選用 g-球蛋白為標準蛋白質,以減少這方面的偏差。
(2)仍有一些物質干擾此法的測定,主要的干擾物質有:去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉 (SDS) 等。
         試劑與器材
         1、試劑
考馬斯亮藍試劑:
考馬斯亮藍 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中,加入 100 mL 85% 磷酸,用蒸餾水稀釋至 1000 mL。
         2、標準和待測蛋白質溶液
(1)標準蛋白質溶液
結晶牛血清蛋白,預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,根據其純度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。
(2)待測蛋白質溶液。
人血清,使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀釋 200 倍。
         3、器材
試管 1.5×15 cm(×6),試管架,移液管管 0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒溫水??;分光光度計。 
         操作方法
         一、制作標準曲線
取 7 支試管,按下表平行操作。
搖勻,1 h 內以 0 號管為空白對照,在 595 nm 處比色。
繪制標準曲線:以 A595 nm 為縱坐標,標準蛋白含量為橫坐標,在坐標紙上繪制標準曲線。 
         二、未知樣品蛋白質濃度測定
測定方法同上,取合適的未知樣品體積,使其測定值在標準曲線的直線范圍內。根據所測定的 A595 nm 值,在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量,從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。
         注意事項
(1)在試劑加入后的 5-20 min 內測定光吸收,因為在這段時間內顏色是MAX穩定的。
(2)測定中,蛋白-染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上,測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。
(3)利用考馬斯亮藍法分析蛋白必須要掌握好分光光度計的正確使用,重復測定吸光度時,比色杯一定要沖洗干凈,制作蛋白標準曲線的時候,蛋白標準品建議是從低濃度到高濃度測定,防止誤差。

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