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酵母感受態細胞的制備和保存
發布時間:2019-05-17   點擊次數:286次

        酵母,如釀酒酵母、裂殖酵母和畢赤酵母,通常用于生物學實驗研究。酵母是易于培養的單細胞真核生物,他們的基因和蛋白質與哺乳動物具有很好的相似性,所以是的生物模型。

        酵母細胞用于研究基因功能,蛋白質相互作用,細胞通路等,也是大規模異源蛋白表達和小分子生產的宿主,在發酵,釀造和制藥行業等起著中流砥柱的作用。涉及酵母的常見的實驗有酵母雙/三雜交系統,突變體篩選庫和同源重組,等等。

        一、為什么我們需要酵母感受態細胞?

        通常,在實驗過程中需外源DNA引入到酵母細胞。引入基因片段(線性ssDNA或質粒)是通過酵母細胞的轉化來實現的,具體方法有化學法,如醋酸鋰和聚乙二醇(PEG)或電穿孔法。有效的酵母轉化需要高質量的酵母感受態細胞為開始。勝任力則是指細胞能吸收游離的細胞外的遺傳物質(如質粒DNA)的能力。

        二、酵母感受態細胞的制備 

        獲得感受態細胞相當簡單,但許多研究人員在實現良好的生存比例和轉換效率時  遇到問題。常見的誤區包括由于制備條件惡劣導致高的細胞死亡率,或由于無效的感受態細胞制備導致轉化效率低。

        雖然酵母細胞和大腸桿菌一樣容易生長和轉化,但它們需要不同的處理方法來制備感受態細胞和轉化。酵母細胞像哺乳動物細胞一樣,有類似的處理程序。典型的酵母感受態細胞制備協議如下:

  1. 過夜培養你想轉化的酵母菌菌株,使用營養豐富的培養基培養不含質粒的細胞。對于已經含有質粒的細胞,使用適當的選擇性培養基來維持質粒。
  2. 當細胞密度達到1 - 2 x 107cells/mL,離心收獲細胞。細胞密度可以通過使用分光光度計在OD600檢測,或者使用血球計在顯微鏡下計數細胞。
  3. 沖洗細胞,重懸于無菌水,離心,棄上清,重復此步驟兩次以徹底清洗細胞。
  4. MAX后一次洗完,將細胞重懸于感受態細胞溶液,分裝,大約每管108個細胞,每個轉化反應將使用這些數量的細胞。分裝好的管子放于-80°C,供以后實驗使用。
  5. 在所有步驟中,使用質量好的無菌過濾器消毒過的試劑,以防止污染問題。

        感受態細胞溶液包含合適濃度的冷凍保護劑,這些濃度應該在你的實驗室標準化,根據使用的酵母菌株和細胞的濃度。標準協議使用5%的甘油 + 10% DMSO溶液混合,這種配方被廣泛應用來制備感受它細胞,也可根據具體情況進行輕微的改變或調整。

        關于冷凍保護劑

        甘油和二甲亞砜(DMSO)是MAX常見的細胞可透過性冷凍保護劑,用于準備感受態細胞。它們穿透細胞,防止冰晶的形成,冰晶可能會在凍結過程中導致膜破裂。甘油和DMSO也有一定的缺點,他們可能會導致細胞毒性,特別是在解凍過程中。非細胞透過性的試劑如蔗糖和海藻糖等也可用于替代物。山梨糖醇鈣也是一個好的冷凍保護劑,尤其適用于電穿孔制備感受態細胞。

        三、酵母感受態細胞的儲存

        每次轉化時使用新鮮的感受態細胞是明智的,因為長時間儲存,轉化效率會降低,但這并不總是可行的。

        感受態細胞可以存儲在-80°C長達一年,沒有轉化潛能的損失。然而, 瞬間凍結在液氮或-80°C冰箱是不建議的。感受態細胞需要在冷凍保護劑中,像哺乳動物細胞一樣緩慢地冷凍。

  1. 使用硬紙板或聚苯乙烯泡沫塑料盒等儲存。
  2. 用紙片等將盒子里的細胞管隔開,分成多個小格子。
  3. 復蘇過程中,在電熱恒溫培養箱37°C解凍細胞,轉化前用豐富培養基清洗防凍劑。

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