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解決貼壁細胞的消化問題
發布時間:2019-05-17   點擊次數:228次

        許多同學對細胞消化做了許多研究,得出了很多有價值的經驗,也見到很多人的困惑。其實細胞培養,尤其是細胞系的培養,就消化而言,不是太難,做得多了,善于總結經驗,就能把細胞越養越好。一般的程序步驟,細節操作,介紹一些基本操作背后的知識,如果不對之處,歡迎指正,一起討論。

        1、其實絕大部分細胞消化的時候是只要用胰酶潤洗一遍即可,吸去胰酶后,殘留的那些無法計算體積的附著在細胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細胞(絕大部分1min不到)。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞,連續這樣傳代,對細胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去,胰酶潤洗吸去,然后電熱恒溫培養箱37度消化。

        2、什么算是消化好了呢?不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了,一般你肉眼觀察貼壁細胞層,只要能移動了,多半呈沙壯移動,其實已經可以了。一般能移動了,說明細胞與培養基質材料的附著已經消失了,細胞之間的附著也已經消失了,細胞已經獨立分布了(雖然沒有呈現很廣的離散分布)。這個時候應該停止消化,不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好,間隙很大,才停止。細胞就是完全成單個細胞懸液,之后在貼壁的過程中仍然會聚集,這個是貼壁培養的細胞,尤其是腫瘤細胞的一個特性。

        3、細胞只要能從基質上脫離下來,這個時候即使是成片的(比如Calu-3細胞),吹打不超過20次后(一般10次即可),成小規模聚集(10個細胞左右),是正常的,不要試圖再去延長消化時間。不要以為成片分布是自己沒養好,這個視細胞而定。如果和標準形態不一致,那可能是自己沒消化好導致的,但如果消化方法正確,仍然成片分布,甚至完全吹打成單細胞懸液,貼壁后仍然成片分布,這是細胞的特性,是因為貼壁過程中重新聚集了。

        4、比較難消化的細胞(潤洗方法5min還不能消化),就以colon cancer為例,比如HCT15, LS411和KM12,這樣的細胞一般需要用少量胰酶孵育,但也不需要很多,一般100 mm dish,一次MAX多加入500ul,就足夠了。即使這樣難消化的細胞,一般不超過5min,即可見細胞成片移動,就應該停止消化。一些正常細胞也會有難消化的時候,比如tsDC細胞,但也只要用少量胰酶孵育,3min左右即可看到成片沙狀移動。

        5、消化時間和細胞類型、消化液的消化能力、細胞的密度等多種因素有關。一般養一種新的細胞要摸索一下消化時間,掌握細胞消化到什么程度恰到好處。新配的消化液消化能力較強,配好后可分裝成小管,一次用完,其余凍在-20℃低溫保存箱內,以保持酶活力。細胞生長到覆蓋70~80%瓶底時消化較好,若細胞密度過大則消化后細胞易成團。

        6、常規的細胞實驗(增殖,凋亡,遷移,分化之類的),如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化的話(難消化細胞例外),受消化影響不是很大。但少數實驗,比如病毒包裝,對細胞代數,對細胞狀態要求極高。這個時候,胰酶消化,就是潤洗,都會對細胞包裝病毒的能力有影響,傳代次數一多,細胞包裝能力就會逐漸下降(當然也有其它因素影響包裝效率)。這個時候都不用胰酶消化,用一些鹽溶液(不是EDTA液)即可。這些鹽溶液通過影響ECM相關酶的活性,來使得細胞脫離基質附著表面,但不切割任何蛋白。 

        7、PBS洗滌。消化之前用PBS洗滌,是常見的操作,因為Serum含有抑制trypsin的蛋白。但這里面也有學問可以講,對于一些難消化細胞,那么可以配制不含Ca,Mg離子的PBS,因為這些離子也會抑制trypsin的活性。但對于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的細胞,不需要配制如此溶液。

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