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化妝品中綠膿桿菌標準檢驗
發布時間:2019-05-21   點擊次數:416次

         綠膿桿菌在自然界分布甚廣,空氣、水、土壤中均有存在。對人有致病力,常引起人皮膚化膿感染,特別是燒傷、燙傷、眼部疾病患者被感染后,常使病情惡化,并可引起敗血癥,因此,在化妝品衛生標準中規定不得檢出綠膿桿菌。  

         1 方法提要
         根據本菌生物學特征:革蘭氏陰性桿菌,氧化酶陽性,能產生綠膿菌素。此外還能液化明膠,還原硝酸鹽為亞硝酸鹽,在電熱恒溫培養箱42℃條件下生長等,可與類似菌相區別。
         2 培養基和試劑
         2.1 SCDLP 液體培養基
見GB 7918.1-87《化妝品微生物標準檢驗方法 總則》。
         2.2 十六烷*基溴化銨培養基
成分: C8H9Cl                  3g
蛋白胨                  10g
氯化鈉                  5g
十六烷*基溴化銨         0.3g
瓊脂                       20g
蒸餾水                    1000ml
制法:除瓊脂外,將上述成分混合加熱溶解,調pH為7.4~7.6,加入瓊脂,115℃(10 1b)20min滅菌后,制成平板備用。
         2.3 乙酰胺培養基
成分:乙酰胺                10.0g
氯化鈉                       5.0g
無水磷酸氫于鉀             1.39g
無水磷酸二氫鉀             0.73g
硫酸鎂(MgSO4·7H2O)            0.5g
酚紅                       0.012g
瓊脂                          20g
蒸餾水                     1000ml
制法:除瓊脂和酚紅外,將其他成分加到蒸餾水中,加熱溶解,調pH為7.2,加入瓊脂、酚紅,121℃(15 1b)20min高壓滅菌后,制成平板備用。
         2.4 綠膿菌色素測定用培養基
成分: 蛋白胨            20g
氯化鎂                  1.4g
硫酸鉀                   10g
瓊脂                     18g
甘油(化學純)             10g
蒸餾水                1000ml
制法:將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中,加溫使溶解,調pH至7.4,加入瓊脂和甘油,加熱溶解,分裝于試管內,115℃(10 1b)20min高壓滅菌后,制成斜面備用。
         2.5 明膠培養基
成分: C8H9Cl             3g
蛋白胨                    5g
明膠                    120g
蒸餾水                1000ml
制法:取各成分加在蒸餾水中浸泡20min,隨時攪拌加溫使溶解,調pH至7.4,分裝于試管內,經115℃(10 1b)20min滅菌后,直立制成高層備用。
         2.6 硝酸鹽蛋白胨水培養基
成分: 蛋白胨           10g
酵母浸膏                 3g
硝酸鉀                   2g
亞硝酸鈉               0.5g
蒸餾水               1000ml
制法:將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中,加溫使溶解,調pH為7.2,煮沸過濾后補足液量,加入硝酸鉀和亞硝酸鈉,溶解混勻,分裝到加有小倒管的試管中,115℃(10 1b)20min滅菌后備用。
         2.7 普通瓊脂斜面培養基
成分:蛋白胨           10g
C8H9Cl                   3g
氯化鈉                   5g
瓊脂                    15g
蒸餾水               1000ml
制法:除瓊脂,將其余成分溶解于蒸餾水中,調pH為7.2~7.4,加入瓊脂,加熱溶解,分裝試管,121℃(15 1b)15min高壓滅菌后,制成斜面備用。
         3 儀器
3.1 恒溫培養箱:37℃、42℃。
3.2 錐形燒瓶。
3.3 試管。
3.4 滅菌平皿。
3.5 滅菌刻度吸管。
3.6 顯微鏡。
3.7 載玻片。
3.8 接種針、接種環。
3.9 電爐。
3.10 高壓消毒鍋。
         4 操作步驟
         4.1 增菌培養:取1:10樣品稀釋液10ml加到90ml SCDLP液體培養基中,置37℃培養18~24h。如有綠膿桿菌生長,培養液表面多有一層薄菌膜,培養液常呈黃綠色或藍綠色。
注:如無SCDLP液體培養基時,可用普通肉湯培養基。檢驗含防腐劑的化妝品時,在每1000ml普通肉湯中加1g卵磷脂、7g吐溫80。
         4.2 分離培養:從培養液的薄菌膜處挑取培養物,劃線接種在十六烷*基溴化銨瓊脂平板上,置恒溫培養箱37℃培養18~24h。凡綠膿桿菌在此培養基上,其菌落扁平無守型,向周邊擴散或略有蔓延,表面濕潤,菌落呈灰白色,菌落周圍培養基常擴散有水溶性色素,此培養基選擇性強,大腸艾希氏菌不能生長,革蘭氏陽性菌生長較差。
在缺乏十六烷*基溴化銨瓊脂時也可用乙酰胺培養基進行分離,將菌液劃線接種于平皿中,放37℃培養24H,綠膿桿菌在此培養基上生長良好,菌落扁平,邊緣不整,菌落周圍培養基略帶紅色,其他菌不生長。
         4.3 染色鏡檢:挑取可疑的菌落,涂片,革蘭氏染色,鏡檢為革蘭氏陰性者應進行氧化酶試驗。
         4.4 氧化酶試驗:取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內,用無菌玻璃棒挑取綠膿桿菌可疑菌落涂在濾紙片上,然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基對苯二胺試液,在15~30s之內,出現粉紅色或紫紅色時,為氧化酶試驗陽性,若培養物不變色,氧化酶試驗陰性。
         4.5 綠膿菌素試驗:取可疑菌落2~3個,分別接種在綠膿菌素測定用培養基上,置37℃培養24h,加入CHCl33~5ml,充分振蕩使培養物中的綠膿菌素溶解于CHCl3液內,待CHCl3提取液呈藍色時,用吸管將CHCl3移到另一試管中并加入1N的鹽酸1ml左右,振蕩后,靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時為陽性,表示被檢物中有綠膿菌素存在。
         4.6 硝酸鹽還原產氣試驗:挑取被檢的純培養物,接種在硝酸鹽胨水培養基中,置37℃培養24h,觀察結果。凡在硝酸鹽胨水培養基內的小倒管中有氣體者,即為陽性,表明該菌能還原硝酸鹽,并將亞硝酸鹽分解產生氮氣。
         4.7 明膠液化試驗,取綠膿桿菌可疑菌落的純培養物,穿刺接種在明膠培養基內,置37℃培養24h,取出放冰箱10~30min,如仍呈溶解狀時即為明膠液化試驗陽性,如凝固不溶者為陰性。
4.8 42℃生長試驗:挑取純培養物,接種在普通瓊脂斜面培養基上,放在41~42℃恒溫培養箱中,培養24~48h,綠膿桿菌能生長,為陽性,而近似的熒光假單胞菌則不能生長。
         5 檢驗結果報告
被檢樣品增菌分離培養后,經證實為革蘭氏陰性桿菌,氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性者,即可報告被檢樣品中檢出有綠膿桿菌。如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產氣和42℃生長試驗三者皆為隉性時,仍可報告被檢樣品中有綠膿桿菌。

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