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動物組織細胞基因組DNA提取
發布時間:2019-05-29   點擊次數:560次

        一、儀器及試劑

        ⒈儀器:

恒溫水浴鍋、臺式離心機、紫外分光光度計(GeneQuant)、移液器、玻璃勻漿器、離心管(滅菌)、吸頭(滅菌)

        ⒉試劑:

(1)細胞裂解緩沖液:

Tris (pH8.0) 100 mmol/L

EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L

NaCL 20 mmol/L

SDS 10%

胰RNA酶 20ug/ml

(2) 蛋白酶K: 稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中,?C20℃備用。

(3)TE緩沖液(pH 8.0):高壓滅菌,室溫貯存。

(4)酚: CHCl3:異戊醇(25:24:1)

(5)異丙醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。

 

        二、操作步驟

        ⒈取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g(0.5cm3),盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中,加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊,轉入1.5ml 離心管中,加入蛋白酶K (500ug/ml)20μl,混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min,也可轉入37℃水浴12~24h,間歇振蕩離心管數次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min,取上清液入另一離心管中。

        ⒉加2倍體積異丙醇,倒轉混勻后,可以看見絲狀物,用100ul 吸頭挑出,涼干,用200ul TE 重新溶解。(可進行PCR反應等,需要進一步純化的按下列步驟進行)

        ⒊加等量的酚? CHCl3?異戊醇振蕩混勻,離心12000 rpm,5min。

        ⒋取上層溶液至另一管,加入等體積的 CHCl3?異戊醇,振蕩混勻,離心12000 rpm,5min。

        ⒌取上層溶液至另一管,加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇,混勻后室溫沉淀2min ,離心12000 rpm ,10min。

        ⒍小心倒掉上清液,將離心管倒置于吸水紙上,將附于管壁的殘余液滴除掉。

        ⒎用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次,離心12000 rpm , 5min。

        ⒏小心倒掉上清液,將離心管倒置于吸水紙上,將附于管壁的殘余液滴除掉,室溫干燥。

        ⒐加200ul TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或?C20℃保存備用。

        ⒑吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

 

        三、常見問題

        ⒈選擇的實驗材料要新鮮,處理時間不易過長。

        ⒉在加入細胞裂解緩沖液前,細胞必須均勻分散,以減少DNA團塊形成。

        ⒊提取的DNA不易溶解:不純,含雜質較多;加溶解液太少使濃度過大。沉淀物太干燥,也將使溶解變得很困難。

        ⒋電泳檢測時DNA成涂布狀:操作不慎;污染核酸酶等。

        ⒌分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8;不純,含有蛋白質等雜質。在這種情況下,應加入SDS  至終濃度為0.5%,并重復步驟2~8。

        ⒍酚/ CHCl3/異戊醇抽提后,其上清液太黏不易吸?。汉邼舛鹊腄NA,可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。

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