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海洋發光細菌和淡水發光菌
發布時間:2019-06-06   點擊次數:824次

      發光細菌作為毒性檢測的生物學方法,因其簡便、快速、靈敏且成本較低而日益受到重視。本試驗項目推薦兩個方法。一為國家環境保護局于1995年發布的發光細菌法(GB/T15441-1995),采用的是海洋發光細菌菌種;二為淡水發光菌法,采用的是淡水型發光菌種。
  明亮發光桿菌T3法(A)
  本方法適用工業廢水、納污水體及實驗室條件下,可溶性化學物質的水質急性毒性監測。
  1.原理
  基于發光細菌相對發光度與水樣毒性組分總濃度呈顯著負相關(P≤0.05),因而可通過生物發光光度計測定水樣的相對發光度,以此表示其急性水平。
  水質急性毒性水平可按選用相當的參比物 HgCl2濃度(以mg/L為單位)來表征,或選用EC50值(半數有效濃度,以樣品液百分濃度為單位)來表征。
  2.樣品的采集與保存
 ?、俨蓸悠渴褂镁鬯姆蚁┮r墊的玻璃瓶,務必清潔、干燥。采集水樣時,瓶內應充滿水樣不留空氣。采樣后,用塑膠帶將瓶口密封。
 ?、诙拘詼y定應在采樣后6h內進行。否則應在生化培養箱2-5℃下保存樣品,但不得超過24h。報告中應寫明水樣采集時間和測定時間。
 ?、蹖τ诤腆w懸浮物的樣品須離心或過濾去除,以免干擾測定。
  3.儀器設備
 ?、偕锇l光光度計:配置2ml或5ml測試管。
  當 HgCl2標準溶液濃度為0.10mg/L時,發光細菌的相對發光度為50%,其誤差不超過±10%。
 ?、?ml或5ml測試樣品管(具標準磨口塞,為制造比色管的玻璃料制作,由專業玻璃儀器廠制造),分別適用于相應型號的生物發光光度計。
 ?、畚⒘孔⑸淦鳎?0μl。
 ?、茏⑸淦鳎簂ml。
 ?、荻考右浩浚?ml。
 ?、尬埽?ml、10m1、25ml。
 ?、咴噭┢浚簂00ml。
 ?、嗔客玻?00ml,500ml。
 ?、嶙厣萘科浚?0ml、250ml、1000ml。
 ?、獍胛⒘康味ü埽ㄅ淠タ谠囈浩?,全套儀器均為棕色):l0ml。
  4.試劑和材料
  除另有說明外,本方法所用試劑均應為符合國家標準的分析純試劑、蒸餾水或同等純度的水。
 ?、?span style="font-family:arial"> HgCl2。
 ?、诼然cNaCl,化學純。
 ?、勖髁涟l光桿菌T3小種(PhotobacteriumphosphoreumT3spp.)凍干粉,安瓶瓶包裝,每瓶0.5g,在2-5℃冰箱內有效保存期為6個月。新制備的發光細菌休眠細胞(凍干粉)密度不低于每克800萬個細胞;當按5(3)④步驟將凍干粉復蘇2min后即發光(可在暗室內檢驗,肉眼應見微光),稀釋成工作液后每毫升菌液不低于1.6萬個細胞((5ml測試管)或2萬個細胞(2ml測試管)(均為稀釋平板法測定)。在生物發光光度計上測出的初始發光量應在600-1900mV之間,低于600mV允許將倍率調至“×2”檔,高于1900mV允許將倍率調整至“×0.5”檔。仍達不到標準者,更換凍干粉。
 ?、苈然c溶液,3g/100m1:取氯化鈉3g于玻璃容器內,用量筒加蒸餾水l00ml。
 ?、萋然c溶液,2g/l00ml取氯化鈉2g,加蒸餾水l00ml于試劑瓶內,2-5℃保存。
 ?、迏⒈任?span style="font-family:arial"> HgCl2標準溶液:0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18、0.20、0.22、0.24mg/L。
 ?、?span style="font-family:arial"> HgCl2母液,ρ=2000mg/L:1/萬分析天平精稱密封保存良好的無結晶水 HgCl20.1000g于50ml容量瓶中,用3g/100m1氯化鈉溶液稀釋至刻度,置2-5℃冰箱備用,保存期6個月。
 ?、?span style="font-family:arial"> HgCl2工作液,ρ=2mg/L:用移液管吸 HgCl22000mg/L母液l0ml于l000ml容量瓶中,用3g/l00ml氯化鈉溶液定容。再用移液管吸取 HgCl220mg/L液25ml于250m1容量瓶中,用3g/l00m]氯化鈉溶液定容。將此液倒入配有半微量滴定管的試液瓶,然后用3g/l00ml氯化鈉溶液,將 HgCl22mg/L溶液按表5-3-6稀釋成系列濃度(一律采用50ml容量瓶)。 HgCl2工作液保存期不能超過24h,超過者務必重配。
  5.試驗程序
  (1)稀釋樣品液
 ?、贅悠芬簻y定前稀釋的條件:
  樣品液預試驗:取事先加氯化鈉至3g/l00ml濃度的樣品母液2m1裝入樣品管,并設一支CK管(氯化鈉3g/100m1溶液),按4②一③所述測定相對發光度。
  若測得的樣品,相對發光度低于50%乃至零,欲以EC50表達結果,則需稀釋。
  若測得的樣品,相對發光度在1%以上,欲以與相對發光度相當的 HgCl2濃度表達結果,則不需稀釋。
 ?、跇悠芬旱南♂屢海簶悠芬旱南♂屢阂宦捎谜麴s水,在定容前一律按構成氯化鈉3g/100ml的濃度添加氯化鈉或濃溶液(母液只能加固體)。
 ?、蹣悠芬合♂対舛鹊倪x擇:
  預試驗:按對數系列將樣品液稀釋成五個濃度:100%、10%、1%、0.1%、0.01%(其對數依次為0、-1、-2、-3、-4),按5(2)和5(3)所述粗測一遍,視1%-100%相對發光度落在哪一濃度范圍。
  正式試驗:在1%-100%相對發光度所落在的濃度范圍內增配到6-9個濃度(例如,若落在0.1%-10%之間,則應稀釋成0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%;若落在1%-10%之間,則應稀釋成1%、2%、4%、6%、8%、10%),按5(2)-(3)所述再測一遍;這6-9個濃度,也可通過查對數表,按等對數間距原則自行確定(例如,若落在1%-10%之間,則應稀釋成10%、6.31%、3.98%、2.51%、1.58%、1.00%其對數相應為1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00,對數間距均為0.2)。
  (2)測定條件
 ?、偈覝兀?0-25℃。
  同一批樣品在測定過程中要求溫度波動不超過±1℃,且所有測試器皿及試劑、溶液測前1h均置于控溫的測試室內。
 ?、趐H:若需測定包括pH影響在內的急性毒性,不應調節待測樣品pH。
  若需測定排除pH影響在內的急性毒性,需在測定前將待測樣品和CK(氯化鈉3g/100m1)的pH調至下值:主要含Cu的水樣為4.5,主要含其他金屬的水樣為5.4,主要含有機化合物的水樣為7.0。
 ?、廴芙庋酰罕痉ㄖ荒軠y定包括溶解氧影響在內的急性毒性。
  (3)測定步驟
 ?、僭嚬艿呐帕校河谒芰匣蜩F制試管架上按以下兩種情況排列測試管。
  a.按5(1)①所述,樣品母液相對發光度為1%以上者,如下排列:
  左側放參比物 HgCl2系列濃度溶液管,右側放樣品管。前排放 HgCl2溶液和樣品管,后一排放對照(CK)管,后二排放CK預試驗管。每管 HgCl2或樣品液均配一管CK(氯化鈉3g/100m1蒸餾水溶液)。設三次重復。每測一批樣品,均需同時配置測定系列濃度 HgCl2標準溶液。
  b.按5(1)①所述,樣品母液相對發光度為50%以下乃至零者,如下排列:
  左側僅放 HgCl20.10mg/L溶液管(作為檢驗發光細菌活性是否正常的參比物濃度,其反應15min后的相對發光度應在50%左右),右側放樣品稀釋液管(從低濃度到高濃度依次排列)。其他同a。每測一批樣品,均需同時配測 HgCl20.10mg/L溶液。
 ?、诩?g/l00ml氯化鈉溶液:用5ml的定量加液瓶給每支CK管加2m1或5ml氯化鈉3g/l00ml(據儀器型號而定)。
 ?、奂訕悠芬海河?ml或5ml吸管給每支樣品管加2ml或5ml樣品液(據5(3)②而定)。每個樣品號換一支吸管。
 ?、馨l光細菌凍干菌劑復蘇
  從冰箱冷藏室2-5℃取出含有0.5g發光細菌凍干粉的安瓿瓶和氯化鈉溶液,投入置有冰塊1-1.5L保溫瓶,用lml注射器吸取0.5m1冷的氯化鈉2g/l00m1(適用于5ml測試管)或lml冷的2.5%氯化鈉(適用于2m1測試管)注入已開口的凍干粉安瓿瓶,務必充分混勻。2min后菌即復蘇發光(可在暗室內檢驗,肉眼應見微光)。備用。
 ?、輧x器的預熱和調零:打開生物發光光度計電源,預熱15min,調零,備用。
 ?、鄼z驗復蘇發光細菌凍千粉質量:另取一空2m1或5ml測試管加2m1或5ml氯化鈉3g/100ml(據5(3)②而定),加10μ1復發光菌液,蓋上瓶塞,用手顛倒五次以達均勻。拔去瓶塞,將該管放入各自型號儀器測試艙內,若發光量立即顯示(或經過5-l0min上升到)600mV以上,此瓶凍干粉可用于測試,低于者按4③處理。菌液發光量先緩慢上升,約持續5-15min,后緩慢下降,約持續4h。滿4h的CK發光量應不低于400mV,低于者更換凍干粉。
 ?、呓o各測試管加復蘇菌液:在發光菌液復蘇穩定(約0.5h)后,按5(3)所述,從左到右,按 HgCl2或樣品管(前)-CK管(后)一 HgCl2或樣品管(前)-CK管(后)…順序,用10μl微量注射器(勿用定量加液器以減少誤差)準確吸取10μl復蘇菌液,逐一加入各管,蓋上瓶塞,用手顛倒五次,拔去瓶塞,放回原位(每管加菌液間隔時間勿短于30s。每管在加菌液的當時務必計時,記錄到秒,即為樣品與發光菌反應起始時間。立即將此時間加15min,記作各管反應終止(即應該讀發光量)的時間。
 ?、喟l光細菌與樣品反應達到終止時間的讀數:按各管原來加菌液的先后順序,當某管達到記錄的反應終止時間,在不加瓶塞的情況下,立即將測試管放入儀器測試艙,讀出其發光量(以光信號轉化的電信號一電壓毫伏數表示)。
 ?、嵊猩珮悠窚y定干擾的校正:
  a.拿掉儀器樣品艙上的黑色塑料管口;
  b.?。?m1測試管(直徑12mm),加氯化鈉3g/ml溶液2m1,將該管放進一裝有少量氯化鈉3g/100m1溶液的5ml管(直徑20mm)內,要使外管與內管的氯化鈉3g/l00ml液面平齊。此作CK管;
  c.另取一2ml測試管,加氯化鈉3g/ml溶液2ml,放入另一裝有少量有色待測樣品液的5ml管內,要使外管與內管的氯化鈉3g/ml液面平齊。此作CKc管;
  d.于CK和CKc二管的內管中同時加復蘇發光菌液10μ1(注意:必須是本批樣品測
  定所用同一瓶復蘇菌液),立即記時到秒,等反應滿15min,迅速放入儀器測試艙,測定兩支帶有內管的5ml測試管的發光量。分別記下發光量Ll(CK管)和L2(CKc管);
  e.計算因顏色引起的發光量(mV)校正值ΔL=L1一L2;
  f.按5(3)⑦和5(3)⑧所述常規步驟測試帶色樣品管及其CK管(氯化鈉3g/l00ml溶液)的發光量(mV)。所有CK管測得之發光量(mV)均須減去校正值ΔL(mV)后才能作為CK發光量(mV)。
  有色樣品溶液測定干擾的校。
  6.質量保證與質量控制
 ?、倜恐Оl光菌的發光強度和穩定性不盡相同,同批樣品測定過程中應使用同一支發光菌,如果需做 HgCl2標準曲線,也應與樣品使用同一支發光菌。如果一支不夠用,可采用同批的兩支混合后使用。
 ?、谏弦话阃ㄓ梅磻獣r間為5min或15min兩種,鑒于我國目前所用發光桿菌的靈敏度和穩定性,采用15min。
 ?、廴沃貜蜏y定結果相對偏差確定為≤1%。
 ?、軠y定應在采集樣品后立即進行,在6h內不能測定應低溫保存,但不得超過24h。
 ?、蓐P于樣品如何稀釋的問題,一般根據樣品毒性大小決定,但是在試驗中至少要選擇六個不同濃度。如果六個濃度的相對發光度在1%-100%之外,可增配若干個濃度,使之落在1%-100%相對發光度范圍內,以求相關方程。
 ?、奕绻麡悠窛舛葹镸AX高極限濃度(即100%)時,其相對發光率都不能使發光強度減少50%,則對樣品的EC50值只能示為>100%。
 ?、哞b于發光細菌法實驗因素的影響,實驗結果具有一定誤差。在評價毒物的劑量一效應關系時,應確定95%置信區間,即T=a+bC±2SE(SE為剩余標準差),以此求出的EC50也有一定的區間,可根據這些結果確定實驗結果的準確性和真實性。對于實驗結果的重現性,就大多數而言,一般EC50值的變異系數在6%-10%。
  7.測試結果的表達
  1)計算樣品相對發光度(%),并算出平均值:
  相對發光度(%)= HgCl2管或樣品管發光量(mV)/CK管發光量(mV)×100
  相對發光度(%)平均值=(重復1)(%)+(重復2)(%)+(重復3)(%)/3
  2)符合5(1)①中樣品母液相對發光度在1%以上者,建立并檢驗 HgCl2濃度(C)與其相對發光度(T,%)均值的相關方程,也可以繪制關系曲線。
 ?、偾蟪鲆辉淮尉€性回歸方程的a(截距)、b(斜率、回歸系數)和r(相關系數),列出方程:
  T=a+bC HgCl2
  查相關系數顯著水平(P值)表,檢驗所求r值的顯著水平。若P≤0.01,且EC50 HgCl2=0.lomg/L±0.02mg/L,則所求相關方程成立;反之,不能成立,必須重測系列 HgCl2濃度的發光量。 HgCl2溶液配制過夜者,必須重配后再測定。
 ?、谝部梢該⒌纳鲜龇匠汤L制關系曲線。即發光度為10%和90%,代入上式,求出相應的二個 HgCl2濃度,在常數坐標紙上,定出二點,畫一直線,即為符合該方程的 HgCl2濃度與相對發光度的關系曲線。
  3)符合5(1)①中樣品母液相對發光度低于50%乃至零,欲以EC50表示結果者,建立并檢驗樣品稀釋濃度(C)與其相對發光度(T)均值的相關方程,繪制關系曲線。
  按7之2)所述方法建立相關方程T=a+bC樣,并檢驗相關系數r、顯著水平(P值)。
  若P≤0.05,則所求相關方程成立;反之,不能成立,必須重測樣品稀釋系列濃度的發光量。
  8.結果評價和報告
  (1)用 HgCl2濃度表達樣品毒性
  1)適用的條件:符合條件(樣品母液相對發光度>1%)并按7之2)建立了合格((P≤0.01、EC50 HgCl2=0.10mg/L±0.02mg/L)的 HgCl2濃度與其相對發光度相關方程者。
  2)表達方法:
 ?、賹y得的樣品相對發光度,代入7之2)的相關方程,求出與樣品急性毒性相當的 HgCl2濃度(一般用mg/L)表示。
 ?、跍y試結果報告同時列舉樣品相對發光度及其相當的 HgCl2濃度值。
  3)適用性:適用于相對發光度在1%以上,特別是50%以上(即不可能出現EC50值)但低于100%(即仍有中、低水平毒性)的樣品毒性測定。
  (2)用EC50值表達樣品毒性
  1)適用的條件:符合條件(樣品母液相對發光度低于50%乃至零)并按7之3)建立了合格(P≤0.01)的樣品稀釋液濃度與其相對發光度相關方程者。
  2)表達方法:
 ?、賹代入7之3)建立的相關方程,求出樣品的EC50值。這里的EC50值以樣品的稀釋濃度(一般用百分濃度)表示。
 ?、跍y試結果報告列舉樣品的EC50值。
  3)適用性:適用于相對發光度在50%以下,特別是零(即毒性水平較高或很高)的樣品毒性測定,后者無法以相當的 HgCl2濃度表達毒性。
  (3)測定記錄格式
  (4)測定結果報告
 ?、賹嶒炇沂覝?。
 ?、诓蓸拥攸c、日期、時間。
 ?、?span style="font-family:arial"> HgCl2濃度或樣品稀釋百分濃度與相對發光度的相關方程:
  T=a+bC
  r= P≤ EC50 HgCl2= mg/L
  L=a+bC a= b=
  回歸方程 r= P<
 ?、軜悠稥C50值(稀釋百分濃度)或相對發光度(%)及相當的 HgCl2濃度(mg/L)。

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